Caratterizzazione attività ECODEG

La presente relazione ha lo scopo di valutare l’attività del prodotto ECODEG nel disattivare e bloccare l’attività virale di virus della famiglia Cornovirus. In particolare è stata verificata l’efficacia di azione nel confronto di COVID-19.

Al fine di raggiungere gli obiettivi della sperimentazione sono state identificate tre fasi successive di lavoro:

• Analizzare la risposta battericida del prodotto
• Analizzare la capacità di aggressione del prodotto nei confronti dei capsidi di cellule assimilabili, in termini di membrana, ai virus (azione diretta contro membrane polilipidiche)
• Analizzare l’azione diretta nei confronti dell’ RNA del COVID-19

Si riportano di seguito i risultati degli esperimenti effettuati:

Test attività battericida

Per la verifica della capacità battericida sono stati effettuati test microbiologici su campioni drogati con ceppi batterici specifici ed è stata verificata la crescita batterica tra i campioni additivati con acqua sterile con quelli additivati con il prodotto tal quale e diluito al 50%.

Sono state effettuate prove per porsi nelle condizioni ideali di misurazione e quindi con piastre non troppo cariche che permettessero un’agevole lettura.

La quantità di detergente per terreno è stata posta in proporzione 1:1. L’obiettivo in questo caso è di porsi in una zona dell’interazione prodotto/batterio che non sia influenzata dalla quantità di prodotto.

E’ noto infatti che un prodotto battericida esercita la sua funzione con un andamento sigmoidale: piccole aggiunte di prodotto ad una coltura non esercitano effetto alcuno, al crescere della quantità di prodotto si ottiene una risposta battericida crescente che tende ad un massimo (corrispondente idealmente al 100% di abbattimento).

Poiché l’obiettivo ea di valutare la capacità battericida e non determinare il minimo dosaggio necessario per ottenere tale effetto, ci si è posti nella zona di plateau della curva in modo da essere indipendenti dall’aggiunta di prodotto ma restando correlati solo alla sua concentrazione.

Fig. 2 – Piastra con aggiunta di 10 ul di soluzione mix – si nota ancora una buona lettura

C) Dopo le prime 2 prove si è testato l’esperimento con 100ul ottenendo una sovrappopolazione della

piastra che diventa illeggibile.

Si è quindi optato per l’utilizzo di 10ul di soluzione per poter avere una buona lettura ed un effetto

diluizione ridotto.

1. 500 μl terreno di coltura batterica (E.coli resistente all’Ampicillina) + 500 μl SOLUZIONE 50%
2. 1000 μl soluzione mix lasciata agire per 3 minuti
3. Prelevati 10 μl di soluzione mix e mescolati con 490 μl di terreno di coltura per batteri (LB) e seminati su piastre Petri con antibiotico (LB + Amp)
4. Conta batterica (0)

Fig. 3 – Piastra con aggiunta di 10 ul di prodotto tal quale – Carica batterica pari a 0

D)

1. 500 μl terreno di coltura batterica (E.coli resistente all’Ampicillina) + 500 μl SOLUZIONE 100%
2. 1000 μl soluzione mix lasciata agire per 3 minuti
3. Prelevati 10 μl di soluzione mix e mescolati con 490 μl di terreno di coltura per batteri (LB) e seminati su piastre Petri con antibiotico (LB + Amp)
4. Conta batterica (0)

Fig. 4 – Piastra con aggiunta di 10 ul di prodotto al 50% – Carica batterica pari a 0

CONCLUSIONI ATTIVITA’ BATTERICIDA:

Sulla base die risultati ottenuti si può concludere che il prodotto presenta delle evidenti attività battericide.

L’utilizzo anche in soluzioni diluite non fa perdere efficacia al prodotto.

Occorre allo stesso tempo valutare le curve di risposta all’azione battericida per poter definire una posologia corretta che garantisca la piena efficacia.

Attività ECODEG su COVID-19

Chiarita l’attività battericida si è verifica l’efficacia del prodotto nei confronti di virus ed in particolare di COVID-19.

Nell’azione antivirale insistono due componenti parallele:

1. la capacità del prodotto di aggredire l’RNA virale e degradarlo
2. La capacità del prodotto di aggredire la membrana esterna del capside (la struttura esterna del virus che contiene e protegge l’ RNA virale)

Il motivo di tale verifica è legato strettamente alle modalità di azione del virus.

Il capside contiene infatti i gruppi proteici atti a permettere al virus di poter aggredire le cellule dell’ospite e permettere all’RNA di penetrare all’interno della cellula ospite. La degradazione del capside mette a uno l’RNA virale che può degradarsi e che, soprattutto, non ha più la possibilità di avere le “chiavi di accesso” per penetrare nella cellula ospite.

Allo stesso tempo l’RNA virale tende a degradarsi in tempi abbastanza lunghi. Un’azione diretta sull’RNA del virus permette di valutare l’efficacia del prodotto a livello di nucleo capside completo evidenziando quindi un’azione degenerante anche nei confronti dell’ RNA virale distruggendo di fatto il virus in qualsiasi forma esso si presenti ( integro o con capside compromesso)

Verifica dell’efficacia del prodotto nei confronti di RNA virale

A partire da RNA totale estratto da tampone di paziente affetto da COVID-19 sono state prelevate tre aliquote, ciascuna contenente 200 ng di RNA totale, in un volume finale di 50 μl.

E’ stato quindi addizionato pari volume rispettivamente di acqua distillata, ECODEG 50% e ECODEG 100%, per un volume totale pari a 100 μl.

Le tre soluzioni sono state incubate a 37°C per 24 ore.

Successivamente all’incubazione, utilizzando il kit commerciale, i tre campioni sono stati purificati e l’RNA eluito in 25 μl di acqua distillata.

A partire quindi dall’RNA ottenuto da ogni condizione sperimentale e da volumi uguali è stato sintetizzato il cDNA. Per valutare l’integrità dell’RNA estratto, i cDNA così ottenuti sono stati analizzati in triplicato in real-time PCR, utilizzando lo strumento QuantStudio3 (Applied Biosystems). L’analisi è stata effettuata utilizzando coppie di primers specifiche per i trascritti di SARS-CoV-2 (come da indicazioni dei CDC di Atlanta e da noi precedentemente validati) attraverso la chimica SybrGreen.

Dall’analisi finale dei dati di real-time PCR è emerso che in presenza del detergente ECODEG si osserva una diminuzione della presenza del genoma virale SARS-CoV-2, rilevabile mediante indagine molecolare, di circa 1.000 volte, indicativo della sua evidente degradazione.

Verifica dell’efficacia del prodotto nei confronti della membrana lipidica

Al fine di valutare la capacità della soluzione d’interesse di degradare la membrana lipidica sono stati effettuati dei test su linee cellulari di derivazione umana coltivate su piastre Petri in adesione alle quali è stato sostituito il terreno di coltura con la soluzione detergente ECODEG al 50% e al 100%. Nello specifico alle cellule è stata aggiunta la soluzione detergente diluita 1:1 con soluzione fisiologica e sono state osservate al microscopio.

Come evidenziato dalle foto dopo soli 30 secondi dall’aggiunta delle soluzioni detergenti si osserva una totale lisi della membrana lipidica.